Tế bào gốc trung mô (MSC)
Tế bào gốc trung mô (MSC), Te bao goc tu nhau thai cuu, có khả năng tự đổi mới và biệt hóa đa giòng, do đó chúng có khả năng chữa bệnh tuyệt vời. Hiện tại chúng tôi cô lập MSC từ tủy xương (BM) và các mô dây rốn (UC).
Gần đây, tế bào gốc trung mô máu cuống cũng được nuôi cấy khá phổ biến tại các phòng thí nghiệm của Việt Nam, đặc biệt là phòng thí nghiệm tế bào gốc tại trường Khoa học tự nhiên.. Các công trình nghiên cứu chủ yếu là thiết lập quy trình nuôi cấy, khảo sát sự tăng trưởng và sự biệt hóa thành tế bào xương, sụn, mỡ,…
Nuôi cấy tế bào gốc trung mô
1. Điều kiện nuôi cấy
Những yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào MSC :
- Giá thể nuôi cấy
- Thành phần hoá lí và sinh lí của môi trường nuôi cấy
- Thành phần pha khí
- Nhiệt độ tối ưu khi nuôi cấy
2. Môi trường và thành phần các chất trong nuôi cấy
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với nuôi cấy vi sinh hay tế bào thực vật, chúng là hỗn hợp các yếu tố dinh dưỡng và các chất khác. Các công trình nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy tế bào động vật thường dung hỗn hợp dung dịch muối sinh lí, huyết thanh và chế phẩm phôi gà làm môi trường. Do thành phần của chúng phức tạp, khó ổn định, nên người ta quan tâm dần đến việc nghiên cứu, tạo các môi trường tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh và ổn định thành phần trong những môi trường nuôi cấy khác nhau (Phan Kim Ngọc, 2006). Tùy theo từng loại tế bào khác nhau mà dung môi trường thích hợp.
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào được thiết lập gần giống như thành phần dịch lỏng trong cơ thể sống bao gồm muối vô cơ, carbonhydrate, vitamin, amino acid, các tiền chất biến dưỡng, nhân tố tăng trưởng, hormone, các yếu tố vi lượng và đặc biệt quan trọng là huyết thanh. Các chất dinh dưỡng thiết yếu giúp tế bào phân chia như amino acid, acid béo, đường, các ion, các vitamin, cofactor và các phân tử cần thiết để duy trì môi trường hóa học cho các tế bào (Phan Kim Ngọc, 2006).
Môi trường dùng để nuôi cấy MSC thông thường là Eagle Minimal Essential Media (MEM) (Eagle, 1959) hoặc Dulbecco’s Modified Eagle’s media (D’MEM) (Dulbecco và Freeman, 1959).
Môi trường Eagle Minimal Essential Media (MEM) còn gọi là môi trường tối thiểu, do Eagle thiết lập. Đây là môi trường cơ bản có chứa nồng độ các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5- 10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào
Môi trường D’MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) do Dulbecco cải tiến từ môi trường E’MEM (Eagle’s Minimal Essential Medium) hiện đang được sử dụng chủ yếu trong việc nuôi cấy tế bào, đặc biệt là tế bào gốc. Nó có nồng độ amino acid cao gấp đôi, nồng dộ vitamin cao gấp bốn môi trường E’MEM, tối ưu cho nuôi cấy tế bào có mật độ cao. Chính vì vậy mà D’MEM là môi trường thương phẩm thích hợp cho nuôi cấy nhiều loại tế bào động vật.
Vai trò của huyết thanh bào thai bò (FBS) trong việc tăng sinh và duy trì tiềm năng biệt hoá cho cả tế bào người và động vật là rất quan trọng.Hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới đều sử dụng các phương pháp thu nhận và tăng sinh tế bào MSC dựa vào tính bám dính của chúng vào bề mặt nhựa được thiết kế đặc biệt, và sử dụng nồng độ huyết thanh thấp để loại bỏ hầu hết các tế bào tạo máu không bám dính. Hầu hết những tế bào không bám dính như những tế bào tạo máu đều được loại bỏ sau khi thay môi trường, chỉ còn lại những tế bào bám dính là MSC trong các hộp nuôi (Trương Định, 2007).
Huyết thanh được bổ sung vào môi trường để tạo điều kiện tối ưu cho nuôi cấy tế bào. Thành phần chính yếu có trong huyết thanh là protein. Ngoài ra nó còn chứa nhiều polypeptid, các nhân tố tăng trưởng, lipid, hormone, amino acid, glucose, ketoacid và các nguyên tố vi lượng như sắt, đồng, kẽm…
Vai trò của huyết thanh trong nuôi cấy tế bào MSC:
- Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng…
- Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích sự tăng trưởng và phân chia.
- Kích thích sự phục hồi các tổn thương tế bào khi tách bằng tác dụng lực cơ học hay dùng enzyme mạnh như Trypsin.
- Bất hoạt Trypsin.
- Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng.
- Tăng tính bám dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi.
- Chống oxy hoá.
Tuy nhiên, giá thành của huyết thanh là khá cao (chiếm 90% chi phí môi trường nuôi cấy). Ngoài ra huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasma. Hiện nay, nhiều nhà nghiên cứu đã và đang xây dựng công thức môi trường nuôi không có huyết thanh (ví dụ như D’MEM F12) hoặc dùng với lượng rất thấp.
Tóm lại, việc nuôi cấy tế bào động vật nói chung cũng như tế bào gốc trung mô thì phức tạp hơn nhiều so với nuôi vi sinh hay tế bào thực vật, vì tế bào động vật rất nhạy cảm với các tác nhân bên ngoài môi trường. Việc nuôi cấy tế bào thì phải tiến hành thay môi trường 2 đến 3 ngày một lần, tránh để tình trạng cạn kiệt các chất dinh dưỡng làm đổi màu môi trường do thay đổi pH sẽ gây chết tế bào. Chất dinh dưỡng giữ vai trò tối cần thiết trong nuôi cấy tế bào, chúng là nhân tố quyết định sự thất bại hay thành công sự phát triển của tế bào in vitro.
Nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc trung mô trên giá thể san hô (4, 5, 6, 7, 16)
Tế bào sau khi nuôi trong chai nuôi sẽ được tách khỏi chai nuôi bằng dung dịch Trypsin- EDTA (Gibco). Dịch tế bào sau khi tách cho vào tube sạch, vô trùng. Bổ sung 5ml môi trường nuôi và cho mẫu san hô vào tube. Huyền phù và quay ly tâm ở tốc độ 1000 vòng/ 1 phút. Sau đó, tiếp tục huyền phù dịch tế bào và quay li tâm 1000 vòng/ 1 phút cho đến lần thứ 5.
Lấy mẫu san hô ra và cho vào chai nuôi, bổ sung môi trường nuôi (IMDM, 15% FBS, Pen/Strep) sao cho vừa đủ ngập mảnh san hô. Ủ trong tủ nuôi ở 370C, 5%CO2.
Sau một ngày nuôi cấy, môi trường được thay bằng môi trường cảm ứng tạo nguyên bào xương như trên. Thay môi trường mới mỗi 3 ngày/ 1 lần.